pcr的dntp浓度

dntp一般多少浓度

dntp指的是脱氧核糖核苷三磷酸。N是指含氮碱基，代表变量指代A、T、G、C、U等中的一种。在生物DNA合成中，以及各种PCRRT-PCRreverse transcription PCR，Real-time PCR中起原料作用。

dNTP溶于pH为7.0的NaOH贮存液中最初的贮存液可稀释到10mol/L分装后存放在－20℃冰箱中。dNTP使用浓度在20200μmol/L之间。4种dNTP必须等浓度配合以减少错配误差。

使用浓度

dNTP在PCR反应中，使用低dNTP浓度，可减少非靶位置启动和延伸时的核苷酸错误掺入。一般可根据靶序列的长度和组成来决定最低dNTP浓度。

例如在100μl的反应体系中，4种dNTP的浓度为20μmol/L,可基本满足合成2.6μg DNA或10pmol/L的400bp序列。使用低dNTP浓度每种dNTP浓度为2μmol/L,能够高度灵敏地1/107扩增ras基因点突变的等位基因。

实际在做PCR时需要加入哪些组分?各组分的浓度如何确定

PCR产物浓度主要取决于模版的量和引物的量.如果模版属于稀有基因,那么产物浓度就不会高.而且你不要回收后才测浓度,PCR结束后就可以跑电泳或者测OD值都很快的.。

另外,计算PCR的产物不要光看浓度,因为你回收后可以用100ulTE去溶解产物,也可以用50.。

PCR中Mg离子和dNTP需要注意哪些问题

dNTP, 含镁离子的 PCR buffer，上游引物，下游引物，taq酶，模板DNA。至于浓度，实际上说明书上都写着有，市售的taq聚合酶都带有10X的含镁离子的PCR buffer，这个使用时稀释10倍就可以保证浓度了，也就是说50ul的反应体系加入5ul。dNTP的话一般是50ul的反应体系加入4ul 2.5 mM的dNTP. 引物的浓度一般是每50ul反应体系加入上下游引物各1ul浓度为20uM左右的引物储存液。酶的话还是看酶的说明书，一般taq聚合酶的推荐是每50ul加入2.5个酶单位左右。模板DNA要根据模板DNA的大小来确定加入浓度的，一般模板DNA片段越小加入的量就越小，反之越大。但总50ul反应体系中，最多不要超过10ug左右。

引物与模板浓度的关系

mg在体系中的浓度一般是1-5mMol/L，dNTPs一般200uMol/L，四种dNTP浓度要相等。

镁离子是taq酶的辅因子，但浓度太高会产生非特异性扩增。

dNTPs太多会结合镁离子，所以二者都要适量。

dNTPs要4度保存

100ul PCR 体系加1ul dNTP（10mM） 少吗？

PCR (聚合酶链式反应)反应包括三个基本步骤，即：模板DNA的变性、模板DNA与引物的退火复性、引物的延伸。PCR反应体系包括5种基本成分，依次为：引物、DNA聚合酶、dNTP、模板DNA、Mg2+。

1、引物

引物是PCR 特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板 DNA在体外大量扩增。

设计引物应遵循以下原则：

①引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。

②引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。

③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸 的成串排列。

④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3’端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。

⑤引物3’端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR 失败。

⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子 克隆很有好处。

⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量： 每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。

2、酶

目前有两种Taq DNA聚合酶供应， 一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U(指总反应体积为100ul时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。

3、dNTP

dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M Tris。HCL的缓冲液将其PH调节到7.0～7.5，小量分装， -20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。

dNTP储存液：dNTP溶于pH为7.0的NaOH贮存液中，最初的贮存液可稀释到10mol/L，分装后存放在-20℃冰箱中。dNTP使用浓度在20～200 μmol/L之间。4种dNTP必须等浓度配合以减少错配误差。

dNTP使用浓度：在PCR反应中,使用低dNTP浓度,可减少非靶位置启动和延伸时的核苷酸错误掺入。一般可根据靶序列的长度和组成来决定最低dNTP浓度。例如在100μl的反应体系中,4种dNTP的浓度为20μmol/L,可基本满足合成2.6μg DNA或10pmol/L的400bp序列。使用低dNTP浓度(每种dNTP浓度为2μmol/L),能够高度灵敏地(1/107)扩增ras基因点突变的等位基因。

4、模板

模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。SDS的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀;蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增。RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。

5、Mg2+浓度

Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。

引物是PCR特异性反应的关键，不好的引物严重影响实验的质量，好的引物可以事倍功半;酶的选择一般是看实验的目的，例如克隆长片段，可能就需要高保真的聚合酶;dNTP浓度和Mg2+浓度高了会影响PCR反应特异性。DNA模板中还有蛋白质也会严总影响PCR质量，因此上述5个基本成分质量和浓度必须合理。

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