incubate-90

hatch和 incubate 的区别？

应用流式细胞仪协议的共轭二抗胞内染色。

A解决方案和试剂

1.1倍，磷酸盐缓冲液（PBS）：溶解8克氯化钠，氯化钾0.2克，1.44 gNa2HPO4and0.24克KH2PO4in 800毫升蒸馏水（dH2O）。调整在室温下用HCl和1 liter.Store量pH值to7.4 。

2.Formaldehyde（甲醇免费）

3.Incubation缓冲区：溶于100毫升1XPBS.Store在4 ° C 0.5克牛血清白蛋白（BSA）

乙固定

离心，吸上清1.Collect细胞。

简要0.5-1毫升PBS.Add甲醛2.Resuspend细胞最后。

浓度为2-4％的甲醛。

10分钟，在37 ° C的3.Fix 。

在冰上4.Chill管1分钟。

荤打孔

加入冰冷的100％甲醇慢慢预先冷冻细胞，而轻轻涡旋，以90％的终浓度methanol.Alternatively，消除之前修复通透1.Permeabilize细胞，离心和悬浮颗粒细胞的90％甲醇。

2.Incubate 30分钟，在冰上。

3.Proceed与染色或储存在细胞在90％甲醇20℃。

d染色使用未加标签，小学共轭二抗。

注意：允许同型相匹配的单克隆抗体或物种的控制匹配，可使用血细胞计数器或其他方法克隆antibodies.Count细胞抗体。

1.Aliquot 0.5 - 1x106到每个检测管细胞（体积比）。

2.Add 2-3毫升每孵化缓冲区管冲洗的centrifugation.Repeat。

在100μl的孵化缓冲区每检测管3.Resuspend细胞。

在孵化缓冲4.Block 10分钟，在室温下。

5.Add在适当稀释法管的主要抗体（见适当稀释个别抗体数据表）。

6.Incubate为30-60分钟，在室温下。

作为孵化前缓冲7.Rinse通过离心。

在荧光共轭二抗*稀释后，8.Resuspend细胞。

孵化缓冲区根据制造商的建议。

9.Incubate 30分钟，在室温下。

作为孵化前缓冲10.Rinse通过离心。

11.Resuspend细胞PBS和0.5毫升的流式细胞仪分析。

*推荐由Invitrogen公司二抗。

阿- 11070 Alexa的福陆公司？488的F（ab'）2片段的羊抗兔IgG（高+长）（1:1000稀释）

阿- 11017 Alexa的福陆公司？488的F（ab'）2片段的山羊抗鼠IgG（高+长）（1:1000稀释）

蛋白质提取问题

不太一样的.

hatch: n. 舱口（建筑物屋顶或地板上的开口，或在船的甲板或飞机上）；v. 孵化--此处指孵出来,重点是出来. hatch还有think out and produce (a plot, plan, etc)策划（阴谋）,拟订（计画）的意思。

而incubate:v. keep (eggs) warm, usu by sitting on them, until they hatch-----指的是"孵化"这一过程,重点是孵化.另外incubate还有（使某事物）逐渐发展, 酝酿的意思.。

简单来说,母鸡坐在蛋上等着就是incubate,小鸡从里面出来就是hatch,在孵蛋这回事儿上差不多可以互通.还是要根据上下文.。

atcc c2c12细胞用什么培养基

蛋白质提取方法-------列举10种方法 。

一、植物组织蛋白质提取方法(summer)。

1、根据样品重量(1g样品加入3.5ml提取液，可根据材料不同适当加入)，准备提取液放在冰上。

2、把样品放在研钵中用液氮研磨，研磨后加入提取液中在冰上静置(3-4 小时)。

3、用离心机离心8000rpm40min4℃或11100rpm20min4℃。

4、提取上清夜，样品制备完成。

蛋白质提取液：300ml

1、1Mtris-HCl(PH8) 45ml。

2、甘油(Glycerol)75ml。

3、聚乙烯吡咯烷酮(Polyvinylpolypyrrordone)6g。

这种方法针对SDS-PAGE，垂直板电泳！

二、

植物组织蛋白质提取方法 (summer)。

三氯醋酸—丙酮沉淀法

1、在液氮中研磨叶片

2、加入样品体积3倍的提取液在-20℃的条件下过夜，然后离心(4℃8000rpm以上1小时)弃上清。

3、加入等体积的冰浴丙酮(含0.07%的β-巯基乙醇)，摇匀后离心(4℃8000rpm以上1 小时)，然后真空。

干燥沉淀，备用。

4、上样前加入裂解液，室温放置30 分钟，使蛋白充分溶于裂解液中，然后离心(15℃8000rpm以上1小。

时或更长时间以没有沉淀为标准)，可临时保存在4℃待用。

5、用Brandford法定量蛋白，然后可分装放入-80℃备用。

药品：

提取液：含10%TCA 和0.07%的β-巯基乙醇的丙酮。

裂解液：2.7g 尿素0.2gCHAPS 溶于3ml 灭菌的去离子水中(终体积为5ml)，使用前再加入1M 的。

DTT65ul/ml。

这种方法针对双向电泳，杂质少，离子浓度小的特点！当然单向电泳也同样适用，只是电泳的条带会减少！

三、

组织：肠黏膜 (newinbio)。

目的：WESTERN BLOT检测凋亡相关蛋白的表达。

应用TRIPURE 提取蛋白质步骤：

含蛋白质上清液中加入异丙醇：(1.5ml每1mlTRIPURE用量)。

倒转混匀，置室温10min

离心：12000 g，10min，4度，弃上清。

加入0.3M盐酸胍/95％乙醇：(2ml每1mlTRIPURE 用量)。

振荡，置室温20min

离心： 7500g，5 min，4 度，弃上清。

重复0.3M盐酸胍/95％乙醇步2 次。

沉淀中加入100％乙醇 2ml。

充分振荡混匀，置室温20 min。

离心： 7500g，5min，4度，弃上清吹干沉淀。

1％SDS溶解沉淀

离心：10000g，10min，4度。

取上清-20 度保存(或可直接用于WESTERN BLOT)。

存在的问题：加入1％SDS 后沉淀不溶解，还是很大的一块，4 度离心后又多了白色沉定，SDS 结晶？测。

浓度，含量才1mg/ml左右。

解决：提蛋白试剂盒，另外组织大小适中，要碎，立即加2X BUFFER，然后煮5－10分钟，效果很好的。

四、

lysis solution:(yog)。

Protein extraction buffer (Camiolo buffer):。

100 ml= (0.075M Potassium Acetate) 0.736g。

(0.3M) NaCl 1.753g。

(0.1M) L-arginine basic salt 1.742g。

(0.01M) EDTA-HCl 0.292g。

(0.25%) Triton X-100 250. ul。

up to 100 ml with dH20. pH 7.4. Then 0.2 um filter.。

1. Freeze tissue in liquid nitrogen.。

2. Rinse in PBS then mince.。

3. Add 1 ml Camiolo extraction buffer per 100 mg of tissue.。

4. Homogenize for 1 minute at 4\\'C.。

5. Spin at 3,000. rpm/15 minutes/4\\'C.。

6. Remove supernatant and save in another tube.。

7. If necessary, dialize the supernatant against PBS with。

50mM/L Tris-HCl pH 7.4.。

五、

植物材料：水稻苗，叶鞘，根(ynibcas)。

1、200 毫克样品置于冰上磨碎。

2、加lysis buffer，离心，10000rpm，4度，5min 取上清。

3、重复离心5min

lysis buffer：urea np-40 ampholine 2-me pvp-40。

六、

蛋白质样品制备(sigma)

秧苗蛋白质样品的提取按Davermal 等(1986)的方法进行。

100mg材料剪碎后加入10mgPVP-40(聚乙烯吡咯烷酮)及少量石英砂，用液氮研磨成粉，加入1.5 ml 10% 三。

氯乙酸(丙酮配制，含10mM 即0.07%β-巯基乙醇)，混匀，-20℃沉淀1 小时，4℃，15000 r/min离心15。

min，弃上清，沉淀复溶于1.5ml冷丙酮(含10 mMβ-巯基乙醇)，再于-20℃沉淀1 小时，同上离心弃上清，

(有必要再用80％丙酮(含10 mMβ-巯基乙醇所得沉淀低温冷冻真空抽干。

按每mg干粉加入20μl(可调) UKS液[9.5 M尿素，5mM 碳酸钾，1.25%SDS，0.5%DTT(二硫苏糖醇)，

2% Ampholine (Amersham Pharmacia Biotech Inc，pH3.5-10)，6% Triton X-100]，37℃温育30min，期间搅。

动几次，28度 (温度低，高浓度的尿素会让溶液结冰)16000 r/min离心15 min，离心力越大时间长一点。

越好！上清即可上样电泳。或者-70 度保存。

七、

植物根中蛋白质的抽取(phenol)。

(1) sample, 液氮研磨。

(2) 装1.5 ml centrifuge 用tube。

(3) 加 1M KH2PO4+K2HPO4 700 ul。

(4) 12000 rpm, 4度, 10-15minite。

(5) 取上层液，蛋白质就在里面。

八、

SDS extraction followed by acetone precipitation – simple extraction protocol that does not require phenol.。

Recommended start protocol for whole tissue extractions.(hgp)。

1. Grind 1 g of fresh tissue to a powder with liquid nitrogen in a mortar and pestle.。

2. Add 5 mL of extraction media (0.175 M Tris-HCl, pH 8.8, 5% SDS, 15% glycerol, 0.3 M DTT) directly to。

mortar and continue grinding for an additional 30 sec.。

3. Filter homogenate through two layers of miracloth into a 50 mL Falcon tube at room temperature.。

4. Immediately add 4 volumes of ice cold 100% acetone to filtered homogenate, mix by vortexing and place at -20。

C for at least one hour to precipitate proteins.。

5. Centrifuge at 5000 g for 15 min to collect precipitated protein, decant supernatant.。

6. Gently blot residual acetone from container with Kimwipe and then wash pellet in 15-20 mL of cold 80%。

acetone. Be sure to thoroughly break-up pellet by pipetting, vortexing or sonication.。

7. Repeat steps 5 and 6.。

8. Collect final protein precipitate by centrifugation at 5000 g for 15 min and dry pellet by inverting on Kimwipe。

for 15 min at 37 C.。

9. Resuspend final pellet in 0.5-1 mL of IEF extraction solution (8 M urea, 2 M thiourea, 2% CHAPS, 2% Triton。

X-100, 50 mM DTT, 0.2% pH 3-10 ampholytes) by pipetting and vortexing at 25-30 C. Incubate sample for 1 h at。

room temperature with agitation. Do not heat sample under any circumstances as this will lead to carbamylation of。

proteins.

10. Centrifuge for 10 min at 12000 g and use supernatant to rehydrate IPG strips.。

11. If protein quantitation is necessary, precipitate protein sample with TCA or acetone prior to performing。

Bradford or Lowry assay as detergents and reducing agents interfere with these assays.。

Phenol extraction followed by methanolic ammonium acetate precipitation – an effective protocol for sample。

preparation from protein-poor, recalcitrant tissues such as plants (see Hurkman and Tanaka, 1986, Plant。

Physiology 81:802-80。

九、

材料：细菌蛋白(puc18)

用甲醇提取的，冻干后用缓冲液溶解的。样品缓冲液是一般的。其中含又2%的SDS，20mmol 的2-巯基乙。

醇。

十、

线粒体蛋白的提取 (bioon)。

Isolation for Mitochondria。

Modification by Bioon。

Materials and reagents:。

homogenizing buffer:。

100 mM mannitol。

10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5)。

5 mM MgCl2

关 于 蛋 白 质

1 mM EGTA

1 mM DTT

leupeptin (0.1 ug/ml)。

0.1M Na2CO3

Methods:

- 10*6 Cells were washed with ice-cold PBS and lysed by homogenizing in 1 ml buffer (ice-cold) containing 100。

mM mannitol, 10 mM Tris, 5 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 1 mM DTT, leupeptin (0.1 ug/ml)。

- Subjected to Polytron homogenization for three-four bursts of 3-10 s each at a setting of 6.5.。

- Intact cells and nuclei were separated by centrifugation at 120 g for 5 min at 4℃。

- Supernatants were centrifuged at 10,000 g for 10 min to collect the heavy (mitochondrial) membrane pellet.。

- Cytoplasmic fractions were obtained by centrifuging supernatants at 100,000 g for 30 min.。

- Resuspended pellet to 0.25mg/ml in fresh preparation of 0.1M Na2CO3 (pH 11.5)。

- Incubated on ice for 30 min.。

- Ultracentrifugation at 100000g for 1h at 4℃ to precipitate the mitochondria membrane protein. And the。

supernatants are mitochondrial matrix. 0.5mg of proteins in mitochondria can get 100ug of proteins (the。

alkali-resistant fractions)。

Ref.: PNAS, 2002，99：12825–12830。

本方法只适用于提大鼠细胞线粒体蛋白，而不适用于线粒体功能检测。

如何养293、293T系列的细胞？

ATCCCRL-1772 C2C12。

基本信息

资源编号 ATCCCRL-1772 。

资源名称 C2C12 。

种属 Mus musculus, mouse muscle 。

类型 myoblast 。

形态 myoblast 。

提供形式 frozen 。

安全等级 1

应用领域 transfection host 。

培养方法

培养基 The base medium for this cell line is ATCC-formulated Dulbecco's 。

Modified Eagle's Medium, Catalog No. 30-2002. To make the complete growth 。

medium, add the following components to the base medium: fetal bovine serum to a 。

final concentration of 10%. 。

传代方法 Protocol: IMPORTANT - DO NOT ALLOW CULTURES TO BECOME CONFLUENT. 。

Cultures must not be allowed to become confluent as this will deplete the 。

myoblastic population in the culture. Myotube formation is enhanced when the 。

medium is supplemented with 10% horse serum instead of fetal bovine serum. 1. 。

Remove and discard culture medium. 2.Briefly rinse the cell layer with 0.25% 。

(w/v) Trypsin- 0.53 mM EDTA solution to remove all traces of serum which 。

contains trypsin inhibitor. 3.Add 2.0 to 3.0 mL of Trypsin-EDTA solution to 。

flask and observe cells under an inverted microscope until cell layer is 。

dispersed (usually within 5 to 15 minutes). Note: To avoid clumping do not 。

agitate the cells by hitting or shaking the flask while waiting for the cells to 。

detach. Cells that are difficult to detach may be placed at 37°C to facilitate 。

dispersal. 4.Add 6.0 to 8.0 mL of complete growth medium and aspirate cells by 。

gently pipetting. 5.Add appropriate aliquots of the cell suspension to new 。

culture vessels. Inoculate at a cell concentration between 1.5 X 10 5 and 1.0 X 。

10 6 viable cells/75 cm2. Corning® T-75 flasks (catalog #430641) are recommended 。

for subculturing this product. 6. Incubate cultures at 37°C.。

Medium Renewal: 。

Every two to three days 。

生长条件 Temperature: 37.0°C 。

生长特性 adherent 。

存储条件 liquid nitrogen vapor phase;Freeze medium: Complete growth medium 。

supplemented with 5% (v/v) DMSO。

Storage temperature: liquid nitrogen vapor 。

phase

详细说明 （可见北纳生物）

描述 The C2C12 cell line differentiates rapidly, forming contractile 。

myotubes and producing characteristic muscle proteins.。

Treatment with bone 。

morphogenic protein 2 (BMP-2) cause a shift in the differentiation pathway from 。

myoblastic to osteoblastic.。

Tested and found negative for ectromelia virus 。

(mousepox). 。

Strain C3H 。

Derivation This is a subclone (produced by H. Blau, et al) of the mouse 。

myoblast cell line established by D. Yaffe and O. Saxel.。

人脑微血管内皮细胞的概括

将细胞培养瓶竖立放置，吸走培养基，如果培养基中的脱落细胞较多，说明细胞现在很容易脱落，只要加入1ml的PBS+EDTA(0.02%)，来回轻微晃动培养瓶直到细胞完全脱落，加入10mlMEM，混匀，不能吹打，分装2瓶。

如果细胞没长满就脱落，则只需加入5mlMEM，不分装。如果培养瓶中的细胞贴壁较牢固，培养基上清没有细胞脱落碎片，且细胞长满达到80％以上，吸走培养基，加入5ml的PBS+EDTA(0.02%)，迅速轻微晃动，竖立培养瓶，吸走，加入1ml0.05%胰酶，37度消化不超过3min。

扩展资料：

注意事项：

1、尽量用早期的细胞，传代太多状态不好，产毒也不好，贴壁困难。

2、塑料的瓶子，DMEM +10%的小牛血清即可，要求并不高，ATCC上有详细的培养方法。

3、主要是传代，胰酶消化点到即止，不能和其它成纤维细胞一样。

4、细胞代数越高生长越快，同时性状和原代差别也更大。一般2-3天传代一次比较合适。

5、传代时细胞密度在80%左右比较好，如果超过90%融合再传会影响细胞状态。

参考资料来源：百度百科-293细胞。

原文地址：http://www.qianchusai.com/incubate-90.html