race-10

race,match,sport,game的区别

1．game 主要指决定胜负的游戏，通常有一套规则，凡参加者均需遵守。可以是体力方面的，也可以是脑力方面的，多用于美语。英国英语则用match. 这时，game和match可以互换。

a football game/match。

a basketball game/match。

a baseball game/match。

a ping-pong match/game。

a tennis match/game。

a boxing match/game。

After a game on the sports field they often become good friends.在运动场上进行一场比赛之后，他们常常变成了好朋友。

They buy tickets or turn on their TVs to watch the games.他们买票或打开电视机看比赛。

2game 作复数时，一般指大型的国际体育运动会、比赛会或学校的游戏课、体育课。如：the Olympic Games=the Olympics 奥林匹克运动会。

3．race n. 赛跑；速度方面的比赛，如赛跑或赛车。

racer n. 比赛者(包括人,动物,车辆等)。

a horse race赛马 。

a 10-mile race 10英里赛跑。

attending the dog races.参加赛狗大会。

race怎么读

①sport通常指“户外运动”、“户外的游戏或娱乐活动”，如打球，跳高，游泳，钓鱼，打猎，赛马和拳术等。以锻炼为主，如篮球、足球、田径运动、划船、赛马等都属于sport。复数形式sports可指运动会。

a favourite sport受人喜爱的运动项目a sport shirt运动衫the school sports学校运动会。

Fishing is my favourite sport. 。

钓鱼是我特别喜爱的一项运动。

People all over the world enjoy sports.世界各地的人们都喜欢运动。

②game（美式用法）意为“游戏”、“运动”，“比赛”，指两队之间有组织的比赛，或比赛的一局(尤指网球，纸牌)。通常指为了娱乐而运动，根据某种规则进行的具体表演，或指以比赛胜负为主的运动。不管是户内或户外，脑力或体力的比赛，都可以叫game。英国英语则用match.这时，game和match可以互换。game的复数形式一般指大型的国际比赛或综合性体育运动会。大多时候，match与game两者可通用。

Can I play computer games first? 。

Some children were playing games on the bank and there were some people rowing on the river。

河岸上有些孩子正在玩耍，河面上有些人正在划船。

The Olympic Games will be held in our country in four years' time. 。

4年以后，奥林匹克运动会将在我们国家举行。

③match(英式用法),意为“竞赛”，“比赛”，大多数是指正式比赛。两队之间有组织的比赛，也指两人之间的比赛。

a football game/match足球比赛a basketball game/match篮球比赛。

Frank plays very well in the match.。

There are two basketball matches next Sunday morning。

④race主要用于赛跑、赛马（车、船等）的比赛。速度方面的比赛，指从起点到终点的竞赛。

a horse race赛马/a 10-mile race 10英里赛跑。

He will take part in an important race across the Atlantic. 。

他将参加一次重大的横渡大西洋的比赛。

已知部分基因序列,如何获得全长基因？

race

英 [reɪs]   美 [reɪs]。

n.  赛跑; 竞争; 人种; 民族;。

v.  参加比赛; 使比赛; 快速移动; 剧烈跳动。

双语例句

1. Before the race, he is fine. But afterwards he is worn out.。

赛前他状态很好，赛后就筋疲力尽了。

2. Duke was soundly defeated in this month's Louisiana governor's race.。

杜克在本月的路易斯安那州长竞选中大败而归。

3. Few jockeys continue race-riding beyond the age of 40.。

很少有职业赛马骑师超过40岁仍继续参加赛马的。

4. Richard Dunwoody is in front in the jockeys' title race.。

理查德·邓伍迪在职业赛马骑师冠军赛中领先其他选手。

5. The centre is open to all, no matter what race or creed.。

该中心向所有人开放，不论种族和宗教信仰如何。

6. Discrimination by employers on the grounds of race and nationality was illegal.。

雇主以种族或国籍为由歧视员工是非法的。

7. A national poll shows the presidential race in a dead heat.。

一项全国民意调查显示总统竞选相持不下。

8. The ball was bobbled momentarily, allowing Holloway to race home.。

球一下子漏了，使得霍洛韦跑垒成功。

9. Meanwhile the race is on to resurface the road before next Wednesday.。

与此同时正赶着在下周三之前把路面重新铺好。

10. He continued to hold a lead in Angola's presi-dential race.。

他继续在安哥拉总统大选中占据领先地位。

请翻译成中文，谢谢

基因是遗传物质基本的功能单位，分离和克隆目的基因是研究基因结构、揭示基因功能及表达的基础，因此，克隆某个功能基因是生物工程及分子生物学研究的一个重点。经典克隆未知基因的方法比如通过筛选文库等有个共同的弊病, 即实验操作繁琐, 周期较长、工作量繁重,且不易得到全长序列。又由于在不同植物中目的基因mRNA丰度不同，所以获得目的基因的难易程度又不一样，特别是对于丰度比较低的目的基因即使使用不用的方法也不一定能获得成功。近年来随着PCR技术的快速发展和成熟.已经有多种方法可以获得基因的全长序列, 比如经典的RACE技术，染色体步移法和同源克隆法等，本文主要综述几种重要的克隆方法的原理和运用，并且比较分析这几种方法的优缺点，为你的实验节约时间和成本。

1. RACE技术

1985年由美国PE-Cetus公司的科学家Mulis等[1]发明的PCR技术使生命科学得到了飞跃性的发展。1988年Frohman等[2] 在PCR技术的基础上发明了一项新技术, 即cDNA末端快速扩增技术( rapid amplification of cDNA ends, RACE), 其实质是长距PCR( long distance, PCR)。通过PCR由已知的部分cDNA 序列, 获得5′端和3′端完整的cDNA, 该方法也被称为锚定PCR ( anchored PCR) [3] 和单边PCR( one-sidePCR) [4]。RACE技术又分为3’RACE和5’端RACE。3′RACE 的原理是利用mRNA 的3′端天然的poly(A) 尾巴作为一个引物结合位点进行PCR, 以Oligo( dT) 和一个接头组成的接头引物( adaptor primer, AP)反转录mRNA得到加接头的第一链cDNA。然后用一个正向的基因特异性引物( gene-specific primer, GSP) 和一个含有接头序列的引物分别与已知序列区和poly(A) 尾区退火, 经PCR扩增位于已知序列区域和poly( A) 尾区之间的未知序列，若为了防止非特异性条带的产生, 可采用巢式引物( nested primer) 进行第二轮扩增, 即巢式PCR( nested PCR) [5，6]。5’RACE跟3’RACE原理基本一样，但是相对于3’RACE来说难度较大。

5'-RACE受到诸多因素的影响而常常不能获取全长，因此研究者都着手改进它。这些措施主要是通过逆转录酶、5'接头引物等的改变来实现的，因此出现了包括基于“模板跳转反转录”的SMART RACE技术( switching mechanism at 5′ end of RNA transcript) [7] , 基于5′脱帽和RNA酶连接技术的RLM-RACE技术(RNA ligase mediated RACE)[8], 利用RNA连接酶为cDNA第一链接上寡聚核苷酸接头的SLC RACE技术(single strand ligation to single-stranded cDNA)[9] , 以及以内部环化的cDNA第一链为模板进行扩增的自连接或环化RACE技术(self-ligation RACE or circular RACE)[10]，和通过末端脱氧核苷酸转移酶( TdT)加尾后引入锚定引物的锚定RACE技术( anchored RACE)[11]。

1.1基于‘模板跳转’的SMART RACE技术。

SMART-RACE技术的最大特点是5′ RACE过程中的“模板跳转”现象,即当反转录进行到mRNA模板的5′末端时,反转录酶表现出末端转移酶活性,在第一链cDNA的3′端加上3-5 个残基(主要是dC) ,随后第一链cDNA与3′端含几个dG的寡核苷酸引物退火,使反转录反应发生跳移,以引物中寡核苷酸为模板继续进行,最终反转录所得产物必然包含完整的mRNA5′末端序列及引物序列,可直接用于RACE-PCR获得完整地5′ cDNA末端。由于上述过程无需接头连接,而且直接以第一链cDNA作为模板进行RACE-PCR ,因此更加简便、快捷。另外,SMART -RACE还采用了降落PCR、抑制PCR、LD - PCR 等先进扩增技术,提高了PCR扩增的敏感性和真实性,降低了非特异的产物背景,因此该技术已被广泛应用于cDNA末端快速扩增,尤其是5’端的克隆。

1.2末端脱氧核苷酸转移酶( TdT)加尾技术 。

传统的5′RACE反应是以TdT对第一链cDNA进行同聚物加尾来引发第二链cDNA的合成[12] ,这种方法经常会导致RACE反应失败或产生一些副产品。其主要原因是同聚物加尾反应难以控制,TdT 加尾时不能区分cDNA是否是全长,非全长cDNA分子被加尾后将在随后的PCR反应中得到优先扩增,从而产生大量的非特异性产物背景，并且TDT的加尾效率比较低[13]。目前许多研究这对其进行了改进。

夏瑞等[11]提出了一种改良的TDT加尾克隆基因5’端的方法。其首先用1个15 bp左右的特异反转录引物代替通用反转录引物Olig( dT) n对模板cDNA进行初步筛选,使合成的cDNA更靠近目的基因的5′端。其次, 两个上游引物采取巢式策略取代一般的poly( dG)n或poly ( dC)n，从而控制第二轮PCR的退火温度, 保证扩增的特异性。并且在PCR过程中采用了如锚定PCR、巢式PCR、降落PCR等方法增加扩展产物的特异性。这些新的改进使得到目的条带的概论增加，并且反转录引物不需要磷酸化, 从而大大节约实验成本。

2.染色体步移法

染色体步行(chromosome walking)是指由生物基因组或基因组文库中的已知序列出发逐步探知其旁邻的未知序列或与已知序列呈线性关系的目的序列核苷酸组成的方法和过程14]。对于基因组测序已经完成的少数物种(水稻、拟南芥等)来说，可以轻松地从数据库中找到已知序列的侧翼序列。但是这毕竟只是研究少数模式植物时的情况，对于自然界中种类繁多的其植物而言，在不知道它们的基因组DNA序列以前，想要知道一个已知区域两侧的DNA序列，只能采用染色体步移技术。因而，染色体步移技术在现代分子生物学研究中占有举足轻重的地位，是结构基因组研究以及功能基因组研究的基础。

目前,分离侧翼序列的染色体步移方法主要有两种,一是结合基因组文库为主要手段的染色体步移技术,构建基因组文库进行染色体步移尽管步骤比较繁琐,但是适于长距离步移,可以获得代表某一特定染色体的较长连续区段的重叠基因组克隆群。随着亚克隆文库条件构建条件的优化及测序技术的进步,这种方法也将更加快捷,准确。另一个是基于PCR扩增为主要手段的染色体步移技术。基于PCR扩增为主要手段的染色体步移技术步移距离相对较短,但是操作比较简单,尤其适合于已知一段核苷酸序列的情况下进行的染色体步移。反向PCR、外源接头介导PCR和热不对称交错PCR(TAIl-PCR)等就是建立在PCR技术基础上的染色体步行技术，为扩增已知序列旁侧的未知DNA片段提供了捷径．这些方法的建立可以不必经过烦琐的建库和筛选过程而获得全长基因序列． 。

2.1连接介导PCR

连接介导聚合酶链反应是以连接反应为基础的单侧PCR技术，首先通过基因组DNA酶切，在酶切后的DNA片段的一端连接上一个公共连接子，而后用这个连接子为引物与另一个基因特异引物进行扩增，得到了包含连接子在内的基因序列。连接介导PCR又分为连接载体的PCR、连接单链接头的PCR和连接双链接头PCR。此方法原理简单,操作方便。

2.1.1连接载体的PCR

　 连接载体的PCR是利用已知基因组DNA序列设计的特异引物和载体通用引物进行扩增获得目的片段的一项PCR技术。操作方法是首先用内切酶酶切基因组DNA和载体质粒DNA，得到小片段DNA和线形字体序列，然后用T4连接酶把载体序列与DNA小片段相连接，以连接产物为模板，以一个基因特异引物和载体引物进行扩展，通过克隆测序得到未知的侧翼序列。

2.1.2连接单链接头的PCR 。

连接单链接头的PCR又叫锅柄PCR，是连接单链接头PCR的典型代表,因其以一个类似锅柄结构的DNA分子为模板而得名[18]。其基本原理是：将基因组总DNA 用能产生5' 端突出末端的内切酶切割；接着连上一条单链的寡核苷酸，其具有两个特点，其一是5'端和限制性片段的突出末端互补，其二是除此以外的序列必须和已知序列中一段完全同源；在PCR 的复性阶段，外源接头就会和其链内同源序列配对而成一个末端部分封闭的分子内环状结构，在TaqDNA 聚合酶的作用下，沿着3' 端将单链部分完全补平后而形成一个锅柄结构，因此这种方法也被称为锅柄PCR。由于其末端是一个反向重复序列，故最后只需一条引物即可完成对目标区段的扩增。

2.1.3连接双链接头PCR 。

双链接头法也称为adapter介导的PCR法[ 19，20]。其主要过程为首先用能够产生粘性末端的限制性内切酶消化基因组DNA,然后将末端配对的接头和限制性片段连接,以其作模板,用接头引物和已知序列特异引物进行PCR扩增,即可获得包含侧翼序列的目标片段。显然，这类方法存在一个问题：即如何抑制接头到接头的非目标扩增。因此许多研究者由对其进行了改进，出现了抑制PCR，多功能接头PCR和T接头PCR[21]。

2.2热不对称交错PCR(TAIl-PCR) 。

热不对称性PCR (thermal asymmetric interlaced PCR, TAIL-PCR)就是建立在PCR技术基础上的染色体步移技术，为扩增已知序列旁侧的未知DNA 片段提供了捷径。该技术由Liu和Whitter于1995年首先研究并报道[22]。以基因组DNA为模板，使用高退火温度的长特异引物和短的低退火温度的简并引物，通过特殊的热不对称(高严谨性PCR和低严谨性PCR交替)循环程序，有效扩增特异产物。该技术具有简单快速、特异性高、分离出的DNA 序列可以用于图位克隆、遗传图谱绘制和直接测序等优点，近年来，被分子生物学研究者广泛应用，成为分子生物学研究中非常实用的基因侧翼序列克隆技术，同时在植物基因克隆方面也取得了很大进展。

TAIL-PCR技术的基本原理是利用目标序列旁的已知序列设计3个嵌套的特异性引物(special prime ,简称sp1 ,sp2 ,sp3 ,约20 bp) ,用它们分别和1个具有低Tm值的短的(14 bp) 随机简并引物(Arbitrary degenerate prime 简称AD)相组合,以基因组DNA作为模板,根据引物的长短和特异性的差异设计不对称的温度循环,通过分级反应来扩增特异引物。

TAIL-PCR包括3轮PCR反应。第1轮PCR反应包括5次高严谨性反应、1次低严谨性反应、10次较低严谨性反应和12次热不对称的超级循环。首先5次高严谨性的反应，使长的高退火温度的特异引物SPl与已知的序列退火并延伸，目标序列扩增成直线性型上升，由AD引物结合产生的非特异性产物的浓度则较低。而后进行1次低退火温度的反应，目的是使简并引物结合到较多的目标序列上，接下来10次较低严谨性的反应可以使两种引物均能与模板退火，从而使原来由高严谨性循环所产生的单链靶DNA复制成双链DNA，为下一轮线性扩增模板做准备。最后是进行12次热不对称的TAIL循环(超级循环即高特异性和低特异性循环交替)，目的片段得以指数性地扩增，扩增的量大大超过了非目标片段。经过上述一系列的反应得到了不同浓度的3种类型产物：TAIL-PCR中间会出现3 种类型的产物。类型1是特异引物和任意引物之间扩增的产物（即目标产物；类型2是单独由特异引物扩增的产物；类型3是单独由任意引物引发的产物。该方法由3步连续的PCR扩增过程构成。经过第一阶段的PCR扩增后，类型2产物的分子数目在3种产物中最多，类型1产物稍低。在第二阶段的扩增中，类型1产物的分子数逐渐升至最高，类型2分子数目基本保持不变，而类型3的分子数目仍然保持很低。在第三阶段结束后，基本上只有类型1产物，即目的产物。

TAIL-PCR的技术难点，首先是引物设计，和一般的PCR反应相比，TAIL-PCR反应对引物的要求较高，引物的设计很是重要。特异性引物和简并引物的选择直接影响扩增的效果。特异引物设计：3个嵌套的特异性引物长度一般在20~30 bp之间，Tm 值一般设为58~68℃。SP1、SP2 和SP3之间最好相距100 bp以上以便在电泳时更容易区分3轮PCR产物。简并引物是按照物种普遍存在的蛋白质的保守氨基酸序列设计的，相对较短，长度一般是14 bp左右，Tm值介于30~48℃之间。AD引物是否最佳与它的简并度、引物长度和核苷酸序列组成有很大关系。

目前一些研究这又对TAIL-PCR进行了该进，比如省去了10个中等严谨度的PCR循环，3次PCR循环中的变性时间由5 s延长到了30 s,更有利于DNA彻底解链，第3次循环增加了热不对称交织PCR,更有利于特异目的片段的富集，把较低特异性反应的温度从44℃降到29℃等，以利于更好的扩增目的片段。

3 .RACE技术与染色体步移方的比较 。

3.1 SMART-RACE与末端脱氧核苷酸转移酶( TdT)加尾技术的比较 。

SMART-RACE技术是目前一种比较成熟的技术，它能够最大限度地提高在反转录反应中获取全长cDNA的可能，成功率高，可以节约时间并且操作程序简单，但是于价格过于昂贵, 试验成本增加, 而且对RNA质量要求很高。TdT加尾扩增法的优化改良, 成功率和稳定性都得到较大的提高，改良的TdT末端加尾扩增法综合了多项PCR扩增方法如锚定PCR、巢式PCR、降落PCR等, 原理简单易懂, 操作性强，能够满足一般基因克隆的要求。

3.2连接介导PCR与TAIL-PCR的比较 。

连接介导PCR原理简单，但其需要DNA内酶切酶切，而内酶切又比较昂贵，增加实验的成本。并且酶切的好坏，接头处理方法是否得当而影响接头与DNA小片段的连接效率，从而导致失败。TAIL-PCR不需要进行DNA酶切而直接用DNA做模板进行扩增，仅仅只需要三轮PCR扩增，就可以得到目的条带。简单、特异性高、高灵敏度、快速、不涉及连接反应这就是TAIL-PCR的优点，但是TAIL-PCR也有缺点，主要是TAIL-PCR 反应需要较多的引物组合。此外,由于AD引物存在有限的结合位点,对于个别的侧翼序列,即使使用不同的简并引物也难以扩增到阳性结果。目前已经有学者提出用RAPD的引物替代AD引物的观点，由于RAPD引物数量很多，所以可以解决AD引物存在有限的结合位点的不足。

4.总结

RACE是一种快速、有效的克隆基因全长cDNA的有效方法。基因的3’端通过RACE技术非常容易得到，但是5’端却比较难，即使用比较昂贵的5’端RACE试剂盒也不一定能得结果。而基于PCR扩增的染色体步移法，却有得天独厚的优势，它不仅仅能用于基因全长的获得而且还可以得到基因5’端的启动子序列。模板仅仅只要基因组DNA就行，原理简单易懂，操作方法也简单易行，并且非常的廉价，适用于不同水平和不同层次的研究者。笔者通过TAIL-PCR技术成功得到了芒果LFY基因的全长及其启动子序列。

魔兽争霸秘籍

RACE RACE(rapid-amplification ofcDNA ends)是通过PCR进行cDNA末端快速克隆的技术。

cDNA完整序列的获得对基因结构、蛋白质表达、基因功能的研究至关重要。 完整的cDNA 序列可以通过文库的筛选和末端克隆技术获得。

近年来随着生物技术的不断发展，出现了许多新基因的方法和手段，如图谱技术、转座子标签技术、mRNA差异显示技术二减法技术以及cDNA文库筛选技术等。但上述方法人多具有实验周期长、技术步骤烦琐且工作量大等特点。cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends, RACE)是一种基于PCR从低丰度的转录本中快速扩增cDNA的5'和3’末端的有效方法，以其简单、快速、廉价等优势而受到越来越多的重视。

经典的RACE技术是由Frohman等(1988)发明的一项技术，主要通过RT-PCR技术由已知部分cDNA序列来得到完整的cDNA5’和3’端，包括单边PCR和锚定PCR。该技术提出以来经过不断发展和完善，克服了早期技术步骤多、时间长、特异性差的缺点(Frohman等,1995:Schaefer,l995: Chen,1998: Bespalova等,1998: Matz等11999)。对传统RACE技术的改进主要是引物设计及RT-PCR技术的改进:改进之一是利用锁定引物((lock docking primer)合成第一链cDNA,即在oligo(dT)引物的3'端引入两个简并的核苷酸【5'-Oligo(dT)16_30MN-3', M=A/G/C;N=A/G/C/T】，使引物定位在poly(A)尾的起始点，从而消除了在合成第一条cDNA链时oligo(dT)与poly(A)尾的任何部位的结合所带来的影响;改进之二是在5‘端加尾时，采用poly(C)，而不是poly(A);改进之三是采用RNase H一莫洛尼氏鼠白血.病毒(MMLV)反转录酶或选择嗜热DNA聚合酶可能在高温h (60 度 -70度 )有效地逆转录mRNA，从而消除了5‘端由于高CC含量导致的mRNA 二级结构对逆转录的影响;改进之四是采用热启动PCR (hot start PCR)技术和降落PCR(touch down PCR)提高PCR反应的特异性。

随着RACE技术日益完善，目前己有商业化RACE技术产品推出，如CLONTECH的MarathoTM技术和SMART TM RACE技术术。邢桂春等(2001)先后使用上述两种盒进行RACE反应，结果发现使用Marathon TM所得到的片断总是比采用SMARTsup]TMRACE盒到所得到的片断短。其原因在于Marathon TM技术反转录反应往往不能真正达到mRNA的5’末端。所以认为，进行RACE反应应当优选SMARTTM RACE盒。以下就国内目前应用最广的SMART TM RACE盒为例，简要概述RACE技术的原理和操作过程。 SMARTTM 3‘-RACE的原理是:利用mRNA的3‘末端的poly(A)尾巴作为一个引物结合位点，以连有SMART寡核营酸序列通用接头引物的Oligo(dT)30MN作为锁定引物反转录合成标准第一链cDNA。然后用一个基因特异引物GSP1(gene specific primer,GSP)作为上游引物，用一个含有部分接头序列的通用引物UPM(universal primer,UPM)作为下游引物，以cDNA第一链为模板，进行PCR循环，把目的基因3‘末端的DNA片段扩增出来。

RACE的优点

与筛库法相比较，有许多方面的优点 。

1）此方法是通过PCR技术实现的，无须建立cDNA文库，可以在很短的时间内获得有利用价值的信息。

2）节约了实验所花费的经费和时间。

3）只要引物设计正确，在初级产物的基础上可以获得大量的感兴趣基因的全长。

实验室现有的RACE试剂盒的简介 。

􀂙RACE是一种从一个相同的cDNA模板进行5‘和3‘末端快速克隆的方法。此方法会产生较少的错误条带。此过程中使用的酶混合物非常适合长链PCR。

􀂙使用此方法的要求是必须知道至少23－28个核苷酸序列信息，以此来设计5’末端和3‘末端RACE反应的基因特异性引物（GSPs）。

RACE引物的设计：

基因特异性引物（GSPs）应该是：

􀂙23－28nt

􀂙50－70％GC

􀂙Tm值≥65度，Tm值≥70度可以获得好的结果 。

需要实验者根据已有的基因序列设计5‘和3‘RACE反应的基因特异性引物（GSP1和GSP2).由于两个引物的存在，PCR的产物是特异性的。

反应中涉及到的一些事项

􀂙cDNA的合成起始于polyA+RNA。如果使用其它的基因组DNA或总RNA，背景会很高。

􀂙RACE PCR的效率还取决于总的mRNA中目的mRNA的量和不同的引物有不同的退火和延伸温度。

􀂙在进行5‘和3’RACE PCR的时候应该使用热启动。

􀂙表4中给出了所有引物的相互关系。重叠引物的设计会对全长的产生有帮助。另外，重叠的引物可以为PCR反应提供一个对照。并不是绝对的要利用设计的引物产生重叠片段。

􀂙引物GSP中的GC含量要在50－70％之间。这样可以使用降落PCR。避免使用自身互补性的引物序列，否则会产生回折和形成分子内氢键。另外，避免使用与AP1互补的引物，尤其是在3‘末端。

如果要用重叠片段来检测设计的引物，GSp1和GSp2之间至少是100－200碱基。只有这样才可以用扩增的产物来鉴定设计的引物是否正确。

􀂙降落PCR可以明显的增加RACE PCR产物的特异性。在最开始的循环中，退火温度高于AP1引物的Tm值，可以增加对特异性条带的扩增。随后的退火和延伸的温度降回到AP1的温度，可以进行随后的PCR循环。

􀂙验证基因特异性引物的对照：

􀁜单个引物的阴性对照：只用一个引物GSP来进行阴性对照。这样不应该产生任何的条带。如果可以看到明显的产物，应该改变循环的参数，或重新设计原始引物。

􀁜利用两个GSPS进行阳性对照：（只有两个GSP可以产生重叠的时候才可以采用此步。）为了确定RNA样品中目的基因确实表达，利用两个GSP和接头连接的cDNA来产生阳性对照。可以产生两个引物之间的重叠大小的片段。如果没有这个片段，应该重复cDNA的合成，或者从一个不同的组织或细胞来源进行cDNA的合成。

􀂙制备和抽提polyA+RNA 。

不要使用DEPC处理过的水。

纯化完mRNA之后，利用琼脂糖凝胶电泳检测mRNA的质量。哺乳动物的mRNA样品是0.5－12kb的拖带，在其中有4.5和1.9kb的rRNA的条带。非哺乳动物的mRNA应略小 。

具体的实验步骤

cDNA第一条链的合成：

􀂃我们建议进行cDNA合成的对照反应，这样可以对样品的cDNA的合成进行鉴定。加入各种试剂之后，在气浴中42度保温一个小时。

注意：在水浴或酒精浴中保温回减少反应体积，从而降低第一链的合成效率。

将管放于冰上，以终止第一链的合成反应。

直接进行第二链的合成。

􀂃cDNA第二链的合成：

第二链合成的酶混合物中，含有聚合酶、RNaseH和连接酶。T4 DNA聚合酶的功能是补平dscDNA的末端。我们建议做阳性对照，试剂盒中提供人类骨骼肌的mRNA。

􀂃建议进行阳性对照,cDNA的质量取决于制备的polyA+RNA的质量。非哺乳动物样品的mRNA大约在0.5－3kb之间。

􀂃通过电泳检测cDNA的产量，与对照进行对比，这样可以有利于在以后的步骤中对cDNA进行稀释。

接头的连接及连接产物的稀释 。

􀂃按照程序进行连接反应。

􀂃如果没有对比样品和对照的产量，利用Tricine－EDTA buffer制备接头连接的dscDNA的1/50和1/250的稀释物，用两种稀释物进行以下的RACE PCR反应，直到鉴定出哪一种稀释可以得到好的效果。

RACE RACE－－PCRPCR扩增扩增 。

•进行5’和3’的RACE－PCR扩增。

•利用以下的程序进行降落PCR反应：

94度30秒

5个循环：94度5秒

72度4分

5个循环：94度5秒

70度4分钟

20－25个循环：94度5秒 。

68度4分钟

注意：

我们建议使用降落PCR反应，这就要求GSP的Tm值≥70度。

当循环结束时，利用1.2%琼脂糖凝胶电泳分析每一个管中的产物5μl，使用适当的分子量marker。

•可以根据你的基因的特异性来设计最理想的循环参数。如果看不到带或者只有微弱的带，在68度多加5个循环。最佳的延伸时间取决于扩增条带的长度。如果片断的长度在2－5kb的时候，经常使用4min，0.2-2kb的时候将延伸时间减到2－3min，对于5－10kb的条带，延伸时间增加到10min。

RACE产物的验证：

􀁻应该对RACE的片段进行验证,以此来确定是否已经扩增了理想的产物。如果得到的是多条带或者研究的是多基因家族的成员，验证是非常有用的。

􀁻有3种验证RACE产物的方法：

（1）比较由GSP和NGSP获得RACE产物。

（2）Southern blot 。

（3）克隆并测序

􀁻我们建议最好测得RACE产物的部分序列。有的时候需要嵌套引物的存在。

比较由GSP和NGSP获得RACE产物。

􀁻对于5‘末端的RACE产物，比较由AP1和GSP1扩增出来的产物和由AP1和NGSP1扩增出来的产物。

􀁻对于3‘末端的RACE产物，比较由AP1和GSP2扩增出来的产物和由AP1和NGSP2扩增出来的产物。这对于鉴定多条带是否是上一个PCR的特异性产物是非常有用的。

􀁻如果条带是正确的，在嵌套PCR反应中的条带应该是略微小一些。基本PCR和嵌套PCR产物的迁移率的不同取决于cDNA结构中GSP1和嵌套引物的位置。

RACE产物的克隆和测序：

􀁻可以利用胶回收试剂盒来回收RACE产物，此试剂盒适合回收2.5kb以下的RACE产物；对于长的片段，可以通过电洗脱获得好的结果。如果你选择使用其他的纯化方法，最后用Tricine－EDTA buffer 30μl重新悬浮DNA样品。

􀁻电泳5μl回收的样品来鉴定回收的质量。

􀁻将回收的PCR产物直接克隆到/A型的PCR克隆载体中。另外还可以利用接头和/或cDNA合成引物中的Not1、Srf1、Xma1、ECOR1等酶切位点，将产物克隆到常规载体中 。

对于5‘端的RACE产物，我们建议挑取至少8－10个不同的克隆以获得5‘端的最大可能性的序列。（反转录并不总是进行到mRNA模板的5’末端，尤其是长模板。另外，T4 DNA聚合酶会移走5‘末端的0－20个碱基。）

􀁻一旦鉴定了含有插入片断的克隆，应该获得多的序列信息。理想的是，可以对整个开放读码框进行测序。包括5‘和3‘的非翻译区。

全长cDNA的获得

􀁻通过部分或全部测序鉴定了RACE产物后，可以通过两种选择获得全长的cDNA。

通过PCR的方法。

通过克隆的方法。

通过PCR的方法获得全长cDNA：

􀂄扩增长的cDNA需要较长的延伸时间，但是如果延伸的时间过长，可以产生拖带，所以要慎重的设计引物。

􀂄根据从5‘和3‘RACE产物获得序列信息设计5’和3‘GSP引物。这些引物应该来自cDNA的3’或者5‘的末端，应该是23－28nt长。不应该在引物的末端加上限制性位点，这样会导致高背景。在某些时候可以设计3’和5‘的嵌套引物。但是还是应该先利用一对引物进行PCR反应。

通过PCR的方法获得全长cDNA：

􀂄进行如下的热循环：

94度30秒

25个循环94度5秒

72度2－15分钟

􀂄延伸的时间应该等于预期的cDNA长度加上2分钟。例如：预期得到6kb的条带，用6＋2＝8分钟的延伸时间。

􀂄注意：如果没有条带或者条带弱，增加5个循环；或者优化PCR的条件。

通过PCR的方法获得全长cDNA：

􀂄在1.2%的琼脂糖凝胶上分析5μl的样品。通常情况下，可以见到一条单一带，如果这样，利用胶来纯化全长的cDNA。

􀂄制备1.2%的TAE buffer制备琼脂糖凝胶。不使用TBE buffer，TBE的胶很难制备全长的cDNA。

􀂄将剩下的45μl反应物点样，选用适当的marker。

􀂄利用长波紫外观察cDNA（≥300nm）切下全长的cDNA。注意：应该尽量减少紫外对cDNA的照射。

通过PCR的方法获得全长cDNA：

􀂄利用胶回收试剂盒回收cDNA。此试剂盒适合回收2.5kb以下的RACE产物；对于长的片段，可以通过电洗脱获得好的结果。如果你选择使用其他的纯化方法，最后用Tricine－EDTA buffer 30μl重新悬浮DNA样品。

􀂄将全长的cDNA克隆到T/A型的PCR克隆载体中。

通过克隆产生全长的cDNA：

􀁺如果你已经获得了含有重叠部分的5‘和3’RACE产物，同时在cDNA的重叠部分含有一个酶切位点的话，通过克隆技术可以获得全长的cDNA。

􀁺利用酶切获得的3‘和5’扩增产物，并且利用T4 DNA连接酶将它们连接起来。利用接头和cDNA合成引物中的内切酶将最终的全长cDNA克隆到载体中。

􀁺在哺乳动物基因组中，NOT1和Srf1酶切非常稀少，大约106bp才出现一次，因此在绝大多数的cDNA中是不出现的。

原文地址：http://www.qianchusai.com/race-10.html